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技术分享第二十二期 论包涵体如何纯化和复性?

发布时间:2022-04-07 16:39:42 来源:ob欧宝娱乐网页 作者:欧宝竞猜官网访问次数:

 

  包涵体(Inclusion Body)是外源基因在原核细胞中表达时,尤其是在大肠杆菌中高效表达时,形成的由膜包裹的高密度(1.3 mg/ml)不溶性蛋白质颗粒,在显微镜下观察时为高折射区,与胞质中其他成分有明显区别。

  包涵体一般含有50%以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白以及脂体、脂多糖等,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

  包涵体大小为0.5-1μm左右,大肠杆菌细胞质中的包涵体直径一般在0.2μm到1.5μm之间。不同的蛋白质具有不同的直径,如干扰素的大小是0.811μm,而牛凝乳酶原的大小是1.281μm。在一些情况下,有些包涵体比较大,直径大于大肠杆菌的直径,使得大肠杆菌有一个突起。大的包涵体可以利用光学显微镜看到。一般情况下,一个细胞仅有一个包涵体。包涵体从来不吸附在膜上,并且不同于真核细胞中的其他细胞器。高精度的投射电子显微镜显示了低分子量包涵体的多孔结构。

  病毒在增殖的过程中,常使寄主细胞形成一种蛋白质性质的病变结构,在光学显微镜下可见,多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成,少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物,不含病毒粒子。有的位于细胞质中(如天花病毒包涵体),有的位于细胞核中(如疱疹病毒),或细胞质、细胞核中都有(如麻疹病毒)。有的还具有特殊名称,如天花病毒包涵体叫顾氏(Guarnieri)小体,狂犬病毒包涵体叫内基氏(Negri)小体。

  细胞中的生物学活性蛋白质常以可溶性或分子复合物的形式存在,功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。而包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体,因此不具有生物学活性。

  包涵体之所以形成可能与重组蛋白在表达过程中缺乏某些折叠辅助因子或环境不适无法形成正确的次级键有关。

  研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体。可能是合成速度太快以至于没有足够的时间进行蛋白折叠,二硫键不能正确配对,过多蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。

  一般含半胱氨酸越多的重组蛋白越易形成包涵体,而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

  重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺乏真核生物蛋白翻译后修饰所需酶类,致使中间体大量积累,容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

  蛋白包涵体是一个广泛存在的现象,在大肠杆菌中,包涵体可在细胞的两个位置出现:细胞质和外周胞质。通常认为蛋白的聚集无论出现在细胞内还是细胞外,都是由于中间体不能完成折叠导致的。包涵体在细胞内形成的位置和特点取决于蛋白表达的方式。当大量表达时,三种不同的(天然的、含有OmpA信号肽的和完全切除天然信号肽的)内酰氨酶都形成了包涵体,但前两者的包涵体在外周胞质,后者却在细胞质内。这些包涵体的大小和形状有相当清楚的差别,这些差别表现在包涵体的表面形态、组成和多肽链构象上。

  细菌发酵液高速离心收集菌体,经超声破碎或者裂解液处理后,高速离心收集沉淀。

  用低浓度的变性剂如2M尿素在50 mM Tris,pH 7.5条件下洗涤包涵体,除去包涵体上粘附的杂质,此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。该步骤一定要作用温和,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解而无法粗纯将杂质分离。

  一般用强的变性剂如尿素、盐酸胍,通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展。通常而言盐酸胍优于尿素,两者比较如下所示:

  尿素(8M-10M):尿素溶解不电离,呈中性,成本低,蛋白复性后除去不会造成大量蛋白沉淀;溶解后的包涵体可选用多种色谱方法纯化。

  盐酸胍(6M-8M):溶解能力强,高达95%以上,溶解作用快而不造成重组蛋白的共价修饰。

  盐酸胍(6M-8M):成本高,酸性条件下易形成沉淀,复性后除去可能造成蛋白大量沉淀;对蛋白离子交换色谱有干扰。

  由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性,加上剧烈的处理条件,使蛋白的高级结构破坏,因此重组蛋白的复性特别重要。通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始,到2M左右时结束。对于盐酸胍而言,可以从4M开始,到1.5M时复性过程结束。

  复性是一个非常复杂的过程,除与蛋白复性的过程控制相关外,还很大程度上与蛋白本身的性质有关:有些蛋白非常容易复性,如牛胰RNA酶有12对二硫键,在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上,而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法,如IL-11。很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般来说,蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度,变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。常用的复性方法有以下几种:

  用复性缓冲液快速稀释溶解的包涵体蛋白溶液,降低变性剂浓度简单地使去折叠的蛋白进行再折叠。

  缺点:慢,体积增加很大,变性剂稀释速度太快不易控制,蛋白会被稀释到很低浓度。

  利用分子筛效应将蛋白质和小分子变性剂分离,实现溶液交换和蛋白质的再折叠。

  减少蛋白聚集的分子间相互作用,将蛋白质结合在分离介质上从而达到使溶液中变性剂浓度稀释和蛋白质纯化的目的。

  根据具体的蛋白性质和需要,可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。主要的检测方法有以下几种:

  一般用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测变性和天然状态的蛋白质,或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

  可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等,利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测,但一般只用于复性研究中的过程检测。

  一般用细胞方法或生化方法进行测定,较好地反映了复性蛋白的活性。值得注意的是,不同的测活方法测得的结果不同,而且常常不能完全反映体内活性。

  复性后的蛋白溶解度增加,变性状态时由于疏水残基暴露,一般水溶性很差,大多形成可见的沉淀析出。

  如ELISA、Western等,特别是对结构决定簇的抗体检验,比较真实地反映了蛋白质的折叠状态。

  在下游生产过程中特别是在医药生产中,以包涵体形式表达的蛋白具有一些优越性。

  1.异源表达的蛋白很容易被宿主细胞内的蛋白酶降解,如果以包涵体形式表达,由于酶攻击的位点被包埋了,可最大限度地抵抗蛋白酶的攻击。

  2.由于包涵体表达的蛋白没有活性,细胞破碎和后续的纯化步骤不用考虑蛋白的失活问题。

  3.包涵体蛋白与宿主细胞其他蛋白的分离比可溶蛋白的分离方法简便且造价低,使用简单的离心或过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白成分有效分离。

  4.有些外源蛋白对细胞有毒或能致死,大量表达会导致细胞死亡,使最终的细胞数量和产物相当低,而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达。

  5.对于以包涵体形式表达的产物比较容易进行在线观测定性,含有包涵体蛋白质的细胞有较大的折射率,不必像可溶的蛋白质需要细胞破碎后使用酶学或者电泳学的方法进行鉴定。

  我们知道某些蛋白在大肠杆菌中表达由于其可溶性低, 因而易形成包涵体,导致蛋白活性下降。

  1.多年的蛋白表达经验,15 台中大型微生物培养摇床及发酵设备、12 台超声破碎仪、中试型高压均质仪等配套设备,可以实现高通量,大规模大肠杆菌表达生产。

  2.具有多种大肠杆菌表达载体 pET 系列、pGEX 系列等;多种表达宿主:标准表达菌株、可增强蛋白表达的菌株T7E、表达毒性蛋白的 C41、增强蛋白可溶性表达的超低温菌株 Arctic、以及其它经过 AtaGenix 优化改造的菌株;通过不同载体和菌株的优化组合,可以实现蛋白的高效表达,蛋白表达成功率超过 95%。

  3.具有完善的大肠杆菌表达、纯化、内毒素控制生产线,可生产高质量蛋白,用于细胞活性实验,动物实验等,满足高质量的蛋白使用需求。

  1. 优化表达体系,包括宿主菌、诱导温度、诱导时间、诱导剂的浓度及培养基。

  摇瓶的表达量为8mg/L, 随后进行了发酵条件的优化,包括培养基成分的优化、分批及补料的测试,70L分批发酵的表达量为60mg/L

  相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善,在不久的将来,预测和设计最佳复性方案将成为可能。返回搜狐,查看更多

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